Introducción

Para hablar de los factores de estrés de las levaduras a reutilizar, primero es importante entender qué es el estrés, ya que predecir cómo va a comportarse una levadura en su primera generación en un mosto determinado puede ser más o menos factible, pero su comportamiento a través de reiterados reúsos se hace más difícil y sigue siendo objeto de estudio.
En el fondo, lo que el cervecero busca es obtener fermentaciones activas y consistentes. Ahora bien, podemos considerar al estrés como la consecuencia de factores que afectan esas dos características, pudiendo ser los propios del metabolismo de la levadura (o de la biomasa), por ejemplo la baja del pH y el incremento de alcohol, a las que es sometida (por nosotros).
Las mutaciones pueden ser también una respuesta a algunos tipos de estrés, por lo que el microcervecero la debe tener en cuenta para proveerse periódicamente de cepas nuevas.
Tener fermentaciones activas y consistentes al reutilizar levaduras es, en otras palabras, mantener a las levas en buenas condiciones fisiológicas a lo largo de los procesos de fabricación y almacenamiento, considerando que la calidad de esas condiciones va a determinar la calidad de la fermentación y de la cerveza.

Existe un buen número de condiciones que provocan estrés en las levaduras durante su uso, y muchas de estas se dan muy rápidamente durante la fermentación, es el caso del cold shock (shock por frío), estrés oxidativo, presión hidrostática, presión dentro del fermentador y del brink (¡Arturito!), y otras producidas por el metabolismo de las propias levas, como ser limitaciones de nutrientes, estrés oxidativo, exceso de CO2, estrés osmótico, baja del pH y los metabolitos tóxicos que ellas mismas producen. Tales condiciones de estrés van variando de lote a lote en las sucesivas reutilizaciones de levaduras, lo que agrega más variabilidad a la que ya otorgan las distintas composiciones de los mostos producidos, es decir que la performance de la levadura va ir cambiando, y va a producir modificaciones en la calidad de la cerveza producida. Por eso, vamos a ver qué es lo que sucede en cada uno de esos tipos de estrés y qué podemos hacer para reducirlo.

¿Qué hace la leva para protegerse de condiciones estresantes?

Normalmente las levaduras cerveceras ales y lagers consumen los azúcares del mosto en el siguiente orden: glucosa, fructosa y sacarosa (previamente hidrolizada a glucosa y fructosa por medio de una enzima), y luego maltosa y maltotriosa. Es decir que si un mosto fermentando entra en estrés, es probable que quede más remanente de un azúcar como la maltotriosa, y no por ejemplo glucosa (más fácil de metabolizar). Pero al ir llegando al final de la fermentación, y mientras aún quedan azúcares en el mosto y el resto de los nutrientes comienza a escasear, se larga a sintetizar otro azúcar llamado glicógeno, que es como un ramillete de polímetros de glucosa, y que usará como reserva de energía. Ese glicógeno es el primer azúcar que va a utilizar luego cuando se inicie su ciclo vital para formar ácidos grasos insaturados y esteroles.

El glicógeno no es el único azúcar que una leva sintetiza para preparase a un período de letargo o de estrés, también, cuando el glicógeno va consumiéndose se sintetiza otro azúcar llamado trehalosa, que es el que protege a la pared celular de la leva en condiciones de estrés.

Tip #1: Se ha observado (Fujiwara & Tamai) que en presencia de oxígeno la cantidad de trehalosa comienza a disminuir, y que la eliminación completa de este azúcar influencia negativamente las fermentaciones y la formación de ésteres. Es por eso que en condiciones de almacenamiento (por ejemplo en un brink) se debe evitar la presencia y la incorporación de oxígeno ya que éste estimularía el consumo de trehalosa con la consiguiente pérdida de la capacidad de inhibir el estrés de la leva almacenada, y por el efecto negativo en la formación de ésteres volátiles que tendrá en los lotes sucesivos de cervezas fermentadas con esa leva.

De todos los tipos de estrés a los que las levaduras son sometidas vamos a ver los más comunes:
1) Osmótico
2) Cambios de temperaturas/acidez
3) Por alcohol
4) Falta de nutrientes
5) Estrés oxidativo
6) Sucesivas reutilizaciones (serial repitching)

Estrés osmótico

Tip #2: El estrés provocado sobre la levadura recuperada de una cerveza de alta densidad inicial puede afectar seriamente su vitalidad, y aunque al microscopio con tinción de Azul de Metileno uno pueda verlas “viables”, no necesariamente tendrán buena vitalidad, sobre todo porque se suma el efecto que produce el haber estado en un medio con alto contenido de alcohol, y muchas veces es la falta de vitalidad la causa que al querer reutilizar una levadura la fermentación arranque tímidamente, o arranque y luego se frene. Es por eso (y muchos cerveceros lo saben) que de ser posible se debe evitar la reutilización de levaduras que provienen de una cerveza de alta densidad, cosa que no es inusual porque muchas veces uno se ve tentado de reutilizarla al ver que en el lote anterior “todo anduvo bien”.

Estrés por cambios de temperatura / acidéz

Es obvio que desde la inoculación de la levadura hasta el almacenamiento de lo que se cosecha para ser reutilizado se somete a distintos cambios de temperatura durante el proceso de replicación y el de fermentación, e incluso con la necesidad de realizar una coagulación rápida de las levas después del descanso de diacetilo bajando la temperatura (cold crash), lo que implica un cambio brusco de la misma, para luego ser sometida a almacenamiento aprox. a 4 °C.
Los sucesivos cambios de temperatura a los que es sometida la levadura durante cada ciclo va acumulando estrés que, según lo recopilado por M. E. Josey en su trabajo Quantification and Understanding of the Fermentative Ability of Re-Pitched Yeast (2018), son los descriptos en la tabla que sigue.

Todos esos cambios fisiológicos a los que es sometida la leva por el estrés térmico van socavando su capacidad de realizar fermentaciones consistentes a lo largo de las sucesivas reutilizaciones. De estos, la disminución del pH durante la fermentación (ej.: de 5,5 a 4,1) y ese estrés progresivo en las fermentaciones tienen un impacto en la concentración de diacetilo producido (Haukeli and Lie, 1978) y de dimethyl sulphide (Anness and Bamforth, 1982) entre lotes.

Tip #3: Es razonable que uno deba ir cambiando las temperaturas a lo largo de las distintas fases a las que son sometidas las levas desde su inoculación hasta el posterior almacenamiento, pero al menos se debe tener en cuenta a 4°C el metabolismo de la levadura es menor, siendo más adecuado que por ejemplo a 10°C en que la levadura va agotando las reservas de protección que hemos mencionado (ej.: trehalosa), y tampoco es recomendable bajar demasiado la temperatura porque el congelamiento produce la cristalización del agua, con el consecuente daño en la estructura de la membrana celular y de algunas organelas, con la consecuente pérdida de viabilidad y vitalidad.

Estrés por alcohol

Cuando la leva pasa de la fase anaeróbica el estrés oxidativo y el estrés osmótico comienzan a decrecer debido al consumo de oxígeno y nutrientes del mosto respectivamente. De esta forma esos dos tipos de estrés se van reduciendo, pero, al entrar en la fase de fermentación, el alcohol comienza a aumentar transformándose en un nuevo factor de estrés. La falta de nutrientes cercano al final de la fermentación, junto a la elevada concentración de alcohol, dan lugar al estrés por alcohol, que tendría un efecto tóxico sobre la levas, y determina lo que conocemos como “tolerancia del alcohol”, que es propio de cada levadura (Casey and Ingledew, 1986; You et al., 2003).

Cabe recordar que una propiedad de las levas es su capacidad de sintetizar trehalosa para reducir la fluidez de su membrana cuando es expuesta a concentraciones crecientes de etanol (Gibson et al., 2007), o sea el mismo tipo de azúcar que ya vimos como responsable en la protección bajo condiciones adversas para la supervivencia. Otros estudios (Fairbairn et al., 2014) han demostrado que cuando las levas son expuestas al etanol durante largos períodos de almacenamiento se reduce su capacidad de producir el éster etil-octanoato en los lotes subsiguientes al de esa exposición al alcohol.

Tip #4: Como ya vimos en el tip #2 no es conveniente la reutilización de levas de cervezas de alta densidad inicial, porque luego del estrés osmótico es sometida al estrés alcohólico, provocando que el siguiente lote en el que se reutilice la leva, el nivel de etli-octanoato se vea afectado, con el consiguiente impacto en el flavour de la cerveza.

La alta tasa de consumo de azúcares y producción de alcohol hacia la mitad de la fase de fermentación demostró tener un efecto en el perfil de flavour de la cerveza producida. Entre los ésteres que aumentan significativamente con la alta producción de alcohol están el etil-octanoato, etil-hexanoato, etil-butirato y el isobutil-acetato. (Yoshioka and Hashimoto, 1983; Pires et al., 2014).

Tip #5: Es evidente que al aumentar la temperatura de fermentación aumentan los ésteres producidos en la mayoría de las levaduras a partir del alto nivel de producción de etanol, por lo que aunque sea bien conocido no está de más decir que las temperaturas de fermentación deben ser establecidos entre ciertos rangos o rampas propios de cada leva para que el nivel de estos éteres sea adecuado al estilo de cerveza que se está fermentando.

Estrés por falta de nutrientes

Tip #6: Tanto la escasez de nutrientes como consecuencia de un mosto pobre en éstos, o por oxigenación inadecuada, o por escasez relativa en el caso de overpitching son causas de falta de vitalidad y viabilidad de la levadura cosechada, así como para la performance del lote que se ha elaborado. Es por esto que si una fermentación fue deficiente por inadecuada proporción de nutrientes, no debe cosecharse de ese lote para posteriores reinoculaciones.

Estrés oxidativo

El estrés oxidativo puede ser definido como la respuesta de las levas al daño que le producen algunas especies de oxígeno (Reactive Oxygen Species o ROS) tales como el anión superóxido (O2.-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Brewing Yeast Oxidative Stress Responses: Impact of Brewery Handling. V. Martin, D.E. Quain y K.A. Smart. 2003). Esos compuestos son producidos como metabolitos por las propias levas durante la fase aeróbica (propagación) previa a la fermentación y puede dañar lípidos, proteínas y ADN (celular y mitocondrial), pero el estrés oxidativo también puede ocurrir durante la fase de fermentación y durante el almacenamiento de levas para futuros lotes. Diversas investigaciones sugieren que la exposición a compuestos oxidantes puede influenciar las características fisiológicas, y en consecuencia a su performance y viabilidad durante las fermentaciones posteriores y sobre la calidad de la cerveza producida. El efecto de este estrés cuando esos “ROS” actúan sobre el ADN mitocondrial se evidencia como mutaciones, con la formación de petit mutantes y con impacto en la capacidad de reproducción de las levas, fermentación y sobre el flavour de la cerveza.

Los estudios expuestos en “Brewing Yeast Oxidative Stress Responses: Impact of Brewery Handling” (V. Martin, D.E. Quain y K.A. Smart. 2003) han demostrado que el impacto del peróxido de hidrógeno sobre la viabilidad de distintas levaduras no es el mismo, sin embargo concentraciones muy bajas tales como 0,01 mM (38 mg/l, o sea 38 ppm) pueden afectar la viabilidad en hasta un 100%.

Tip #7: Aunque la fermentación es un proceso anaeróbico, las levas provienen de la fase aérobica (propagación), es decir han sido expuestas a una fase en que el mosto ha sido oxigenado, y durante el almacenamiento si es expuesto a oxígeno, causando estrés oxidativo. Por eso, sería importante no sobreoxigenar el mosto, purgar el brink de todos los restos de ácido peracético (es oxidante) con agua hervida y enfriada, y eliminar totalmente el oxígeno del brink reemplazando todo el aire con CO2.

Estrés por sucesivas reutilizaciones (serial repitching)

Las levaduras que atraviesan sucesivas reutilizaciones sufren un deterioro en su pared celular, donde van quedando como “cicatrices” (por así decirlo). Ello es producto del proceso de replicación en que la leva madre da lugar a una hija. Tal proceso de replicación no es indefinido y la máxima capacidad de divisiones de una leva es lo que se llama “Hayflick limit”. Una vez alcanzado ese número de procesos de multiplicación la leva ya no puede producir más células hijas y la célula “envejecida” por este proceso no es capaz de responder a condiciones de estrés, por lo tanto muere. Es decir, acá el “envejecimiento” no depende del tiempo sino de la cantidad de veces que se ha replicado.
Los signos de “envejecimiento” de las levaduras que se observan tras el microscopio son los siguientes: incremento en el número de “cicatrices”, incremento en el tamaño de las levaduras, arrugas superficiales, gránulos en el citoplasma y hasta retención de células hijas (Handbook of Brewing. Second Edition. Fergus G. Priest, Graham G. Stewart, Editors, 2006).

Tip #8: El número de reutilizaciones de levaduras cosechadas que se hace en las distintas cervecerías es variable, pero antes de la reutilización es necesario cuantificar el porcentaje de levas viables para saber cuántos kilos o litros de biomasa inocular. Muchas de estas cervecerías se quedan en la simple cuantificación de ese porcentaje y en determinar el pitch rate, sin pasar a la observación microscópica del preparado en 1000x aumentos. Siendo que la muestra ya está preparada (por ejemplo, por tinción con Azul de Metileno) se recomienda la observación con aceite de inmersión para ver el estado de “vejez” que tienen las levas, y tomar la decisión de reutilizar o dejar de reutilizar esas levaduras. El proceso es simple y los signos de envejecimiento a tener en cuenta son los detallados más arriba, y es más fácilmente observable en las levas que ya están muertas; dichos signos suelen verse coloreados por el Azul de Metileno.

Bonus track

A continuación hay un par de fotos tomadas en 1200x de un preparado de levaduras con Azul de Metileno. Obviamente se trata de levaduras muertas (están teñidas), pero en una se observa un núcleo en cada levadura, en tanto que en la otra se observan signos de stress y/o “envejecimiento”.